1,25(OH)2VD3诱导培养兔骨髓细胞FOS蛋白产生的实验研究

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所属分类:正畸常识

【摘要】 目的 观察1,25二羟维生素D3[1,25( OH)2VD3]对培养兔骨髓细胞产生立即早期基因c-fos的蛋白产物(FOS蛋白)的诱导作用 。方法 在原代培养至第六代的兔骨髓细胞中加入含5×10-5M /L 1,25(OH)2VD3的培养液,继续培养3小时后,固定标本,进行FOS免疫组化反应。结果 大部分细胞形态正常,胞核呈棕黄色,椭圆形,胞浆不着色,细 胞轮廓清晰,表现为FOS免疫组织化学反应阳性。结论 1,25(OH) 2VD3能够诱导兔骨髓细胞表达FOS蛋白,提示它可能通过c-fos这条信号转导途径在骨组织 改建过程中发挥作用。
【关键词】 1,25二羟维生素D3骨髓细胞立即早期 基因c-fos

1,25二羟维生素D3[1,25(OH)2VD3]是维生素D3代谢衍 生物,是一种具有广泛生物效应的激素前体,是调节骨质代谢的中心环节。Beresford等 [1]报道VD3是一种对成骨细胞生长、分化有重要作用的调节因子,可能对骨组织的 形成有直接的影响作用。本文利用FOS蛋白免疫组化方法观察了1,25(OH)2VD3对培养兔 骨髓细胞FOS蛋白产生的诱导作用。

材料和方法

1.材料:1,25(OH)2VD3(第四军医大学赵大为博士惠赠),羊抗兔FOS血清( 北京中山生物技术公司),生物素化IgG(Sigma),ABC复合物(Sigma),DMEM培养液(Gibco),FBS (浙江金华清湖犊牛利用研究所),胰蛋白酶(上海浦东生化试剂厂),CO2细胞培养箱(美国 Forma Scientific公司),YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂),倒置显微镜及照相系统( Olympus),Triton-X100(华美生物工程公司)。
2.兔骨髓细胞的培养:出生1天的新西兰幼兔1只,断头处死,无菌条件下取四肢长骨,纵行 切开,用DMEM培养液冲洗骨髓腔,轻轻吹打,静置1分钟,使大块组织沉降,取上清进行培 养。24小时后换液,去除未贴壁的血细胞,以后每3天换液1次,0.25%胰酶常规传代。 倒置显微镜下进行观察。
3.FOS免疫组织化学反应:将培养至第6代的骨髓细胞接种于放有载玻片的小培养皿内,待长 满后,在实验前一天换液。弃去原培养液,加入含5×10-5M/L 1,25(OH)2VD3的 培养液1ml,放入培养箱内3h后,将载玻片取出,0.01mol/L PBS冲洗5min后,用4%多聚 甲醛固定15min,将玻片放于0.3%Triton X-100,30min;0.01mol/L PBS冲洗3次,每 次10min;然后将切片入兔抗FOS血清(1:1000),4℃,孵育48h;再入生物素化IgG(1:500), 4℃孵育12h;再放入ABC复合物(1:500),4℃孵育12h。以上各步骤间均用0.01mol/L P BS(PG7.4)冲洗3次,每次10min。呈色反应前,用双蒸水漂洗5min,然后用DAB-H2O 2法呈色15min,Olympus BH2显微镜下观察,照相。对照组内加入不含1,25(OH)2VD3 的培养液,余过程同实验组,另取二张玻片固定后行ALP钙-钴法染色和HE染色。

结果

1.原代培养的骨髓细胞约24小时贴壁,细胞最初为长梭形,传代后体积逐渐变大 ,成为多边形。HE染色见细胞胞浆丰富,核圆形,居中,有2~3个清晰可见的核仁(图1)。A LP染色结果示约7%~8%的细胞ALP阳性,胞浆内可见黑色颗粒。

图1 显示骨髓细胞HE染色 ×20

2.FOS免疫组化结果显示,所有的细胞形态正常,胞核呈棕黄色,圆形,胞浆不着色,细胞 轮廓清晰,表现为FOS阳性反应(图2)。

图2 显示骨髓细胞FOS免疫组化阳性反应 ×20

3.对照组的FOS免疫组化结果显示,所有的细胞核均未着色,为FOS免疫组化阴性反应。

讨论

1,25(OH)2VD3是一类含类固醇的物质,它是维生素D(VD)的活性代谢产物 。近年来的研究发现,它能抑制细胞的增殖、诱导细胞的分化,被广泛应用于内分泌系统、 免疫系统、肿瘤等疾病的治疗[2]。1,25(OH)2VD3是通过其受体发挥生物学效 应的,其受体不仅分布于与骨、钙代谢有关的小肠、肾和骨等组织,还存在于脑、肝、皮肤 、牙齿等器官。1,25(OH)2VD3是调节小肠钙磷吸收的主要激素,能促进钙结合蛋白合 成,加速钙吸收。同时可增加破骨细胞的活性、促进骨钙吸收,从而在骨代谢与改建过程中 起重要作用。

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